干货 | Index这件小事，你get了吗?

各位NGSer是否经常碰到Index，Barcode，Adapter，Sample sheet等一系列问题？例如在Sample sheet输入时，Index序列和测序序列傻傻分不清楚，在数据拆分时，正向拆分反向拆分造成重复工作。今天小V就带大家来捋一捋Index这件小事，让Sample sheet输入与数据拆分不再是问题。

文库结构

说起Index，当然离不开文库结构，我们可以把文库构建简单的理解成在DNA的两端加上可以用于测序以及文库拆分的接头结构。构建好的文库通常由P5、Index2、Rd1 SP、DNA Insert、Rd2 SP、Index1、P7这7个部分构成。其中，P5和P7分别与Flowcell上的接头引物序列互补和相同，进行簇生成。Index又称Barcode，是我们进行文库混合测序时用于数据拆分的一个标签，其中与P5端连接的Index称为Index 2，又称之为i5；与P7端连接的称为Index1，也称为i7。

接头种类

通俗一点讲，接头就是我们在建库的过程中加上的一段核苷酸序列。接头的分类有两种方式：

o分类依据一：index数目，可分为单端Index&双端Index。

单端Index文库指文库结构中只有一端（一般是在P7端）含Index结构（如图2），双端Index文库指文库P5和P7端都含Index（如图3）。单端Index和双端Index能够影响最终混库数量。超高通量Novaseq S4的发布后，测序通量大大增加，运行一次数据产出急剧上升，导致Index多样性的需求增大，双端Index可以进行Index之间正交组合，能够很好的解决这一个问题，并且针对目前patterned flowcell机型产生的标签跳跃问题，也有一个很好的缓解作用。

o分类依据二：能否进行PCR-free文库构建，可分为完整Y型接头&非完整Y型接头。

根据接头连接能够匹配PCR-free文库的要求，可将接头分为完整Ｙ型接头和非完整Ｙ型接头。完整接头包含P5/P7序列，Index，以及Read1/Read2序列，通过TA连接后便能形成完整的文库结构，再文库产量足够的情况下，可不进行PCR扩增直接上机测序。非完整接头只包含Read1/Read2序列，Index和P5/P7需通过PCR扩增引入文库结构中。

注：转座酶文库的接头不是通过TA连接的方式连接，但是引入Index的方式与非完整接头类似，通过转座酶打断的过程中引入Read1和Read2，再经过PCR过程引入Index和P5/P7，形成完整的转座酶文库。

Index 选择策略

在进行多个样本混样上机测序时，需要选择多个含不同Index序列的接头，此时需注意选取的接头组合的碱基平衡和激光平衡。

• 碱基平衡

碱基平衡是指Index的复杂度和平衡度，主要从碱基的种类和碱基的分布两方面考虑。这里的碱基平衡指的是多个Index之间的平衡，而不是单个Index内部的碱基平衡。好的Index组合要遵循两个原则：1、同一组Index中的每一个位置，同时存在A/T/C/G四种碱基，不缺少任何一种碱基；2、4种碱基的比例接近，分别为25%左右。

• 激光平衡

当不能保证碱基平衡时，可以退而求其次，考虑激光平衡。例如Illumina的4通道测序仪，使用绿色荧光标记dG/dT，使用红色荧光标记dC/dA。为了保证测序能顺利进行，每个循环里绿色和红色两种荧光信号都必须存在。因此在选择Index时需要考虑绿色信号和红色信号的平衡。

Index 读取策略

双Index PE测序策略（Novaseq、Miseq、Hiseq2500）

这种双Index PE策略的4个步骤分别为：

（1）Read1读取；

（2）Index1（i7）读取；

（3）桥式PCR扩增过程中进行Index2（i5）读取；

（4）Read 2读取。

双Index PE测序策略（Nextseq、Miniseq、Hiseq3000/4000、HiseqX）

这种双index PE策略的4个步骤分别为：

（1）Read1读取；

（2）Index1（i7）读取；

（3）倒链之后Index 2（i5）读取；

（4）Read 2读取。

Index Sample sheet 输入指南

由于Index引入方式不同，i7端的Index Sample sheet输入存在相同和反向互补的情况。由于Illumina不同机型双Index PE 测序策略中Index2（i5）的读取方式不同，i5端的Index Sample sheet输入存在相同和反向互补的情况。

双Index 输入指南

oIndex 1（i7）输入指南

oIndex2（i5）输入指南

单Index 输入指南

o单Index文库是指i5段Index2的位置由固定序列替代的一个种文库，这种文库只需要考虑Index1（i7）端的Sample sheet输入。

Vazyme不同货号Index搭配混用指南

转座酶接头TD系列：TD202中的N710与TD203中的N808序列相同。

单端Index接头系列：N801&N802与N805-N808中的有三个Index有部分相同序列：Index 5与N808 中的DNA Adapter 96-93局部重复；Index7 与N805中DNA Adapter 96-07、Index13与N805中DNA Adapter 96-24局部重复。

所以，小编提醒大家，在选择Index时尽量避免以上几种有部分相同序列的Index混用哦~

梳理过后，是不是发现Index这件小事get起来其实也不难呢？

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